1、2022?07?11发布2022?10?01实施蜜蜂孢子虫病诊断技术41中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX11.220CCS B41382022Protocol of diagnosis for nosema disease in honeybees中华人民共和国农业农村部发 布41382022NY/T41382022中国农业出版社出版购买正版纸质文本请联系中国农业出版社标准质量分社冀编辑?电话?前?言本文件按照?标准化工作导则?第?部分?标准化文件的结构和起草规则?的规定起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别专利的责任?本文件由农业农村部畜牧兽
2、医局提出?本文件由全国动物卫生标准化技术委员会?归口?本文件起草单位?吉林省养蜂科学研究所?本文件主要起草人?王志?牛庆生?李志勇?庄明亮?王琦?何金明?李剑飞?孙智禹?蜜蜂孢子虫病诊断技术?范围本文件规定了蜜蜂孢子虫病的临床诊断?采样及实验室诊断等内容?本文件适用于蜜蜂孢子虫病的诊断?规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款?其中?注日期的引用文件?仅该日期对应的版本适用于本文件?不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?蜜蜂微孢子虫病诊断方法?熊蜂微孢子虫检疫技术规范?术语和定义下列术语和定义适用于本文
3、件?蜜蜂孢子虫病?由蜜蜂孢子虫引起的蜜蜂成虫肠道传染病?别名微粒子病?蜂场?可作为单一流行病学单元进行管理和防治的一个或一组蜂箱组成的场地?蜂群?由蜜蜂组成的社会性群体?也是蜜蜂自然生存和蜂场饲养管理的基本单位?一个蜂群由一只蜂王?数千至数万只工蜂和若干只雄蜂组成?设备和材料?研钵?培养皿?玻片?光学显微镜?电子天平?精度?扩增仪?电泳仪?凝胶成像系统?冰箱?试剂?水?符合?中一级水的规格?乙醇溶液?以上?缓冲液?含?聚合酶?缓冲液?配制方法见附录?中的?琼脂糖凝胶?配制方法见?相对分子质量标准物?引物?见附录?中的?临床诊断?蜂群症状患病蜂群蜂箱外壁及周围地面上出现棕色长条状的粪便痕迹?个体
4、症状?工蜂症状患病工蜂飞翔能力下降?蛰刺反应丧失?腹部末端变黑?第?第?腹节背板呈棕黄色?略透明?少数腹部膨大?中肠呈灰白色?无环纹?无弹性和光泽?易破裂?蜂王症状患病蜂王产卵力下降?结果判定临床诊断为蜜蜂孢子虫病时?出现?的典型症状?可判为疑似阳性?采样?采样比例蜂群及蜂王采样比例按?的规定执行?采样方法?工蜂采样从每个待检蜂群中随机采集?只工蜂?标记群号?立即镜检?若现场无法检测?将蜂样保存于?以上的乙醇溶液中?备镜检?蜂王粪便采样将待检蜂王放入培养皿内?标记群号?收集蜂王粪便放入冰箱?冷藏备用?采样后将蜂王送回原群?显微镜诊断?样品制备取活体工蜂中肠?放入研钵?按照?加入蒸馏水?充分研磨
5、?备用?取蜂王粪便放入离心管中?按照?加入蒸馏水混匀?备用?镜检从?制备的样品中取?滴于载玻片?盖上盖玻片?在?光学显微镜下观察?先看中间?调节微调旋钮?慢慢移向四周?保证每个标本观察不少于?个视野?典型特征镜检时?蜜蜂孢子虫为特征性的鉴定对象?蜜蜂孢子虫类似谷粒状的椭圆形粒子?并有微弱的蓝色折光?粒子长?宽?结果判定镜检观察到?的典型特征?可判为阳性?见?诊断?设立对照每次反应设置空白对照?阴性对照和阳性对照?空白对照可用水代替样品?阴性对照为未感染蜜蜂孢子虫的健康蜜蜂腹部组织?阳性对照为感染蜜蜂孢子虫的蜜蜂腹部组织?提取按照?的规定执行?扩增按照表?配制?的?反应体系?设置?反应程序如下?
6、预变性?变性?退火?延伸?共?个循环?补充延伸?保温?同时设阳性?阴性和空白对照?得到?扩增产物?扩增也可以采用等效的商品化?扩增试剂盒?表?反应体系试剂加样量?缓冲液?聚合酶?模板?上游引物?下游引物?总体积?电泳检测制备?琼脂糖凝胶?取?扩增产物进行电泳?恒压?电泳约?凝胶成像系统下观察结果?结果判定经?扩增并电泳后阳性对照出现一条大小约?的特异性?条带?而阴性对照和空白对照无条带时?成立?待检样品出现大小约?的?条带并经测序验证?测序结果同参考序列同源性达到?以上?可判为阳性?综合判定凡具有第?章的临床症状?并符合第?章或第?章的阳性结果?可判为蜜蜂孢子虫病?附?录?资料性?主要溶液配制?缓冲液蒸馏水?浓缩液?取?浓缩液?加入蒸馏水定容至?琼脂糖凝胶琼脂糖?缓冲液?核酸染料?将?琼脂糖加入?缓冲液中?加热溶解?冷却至?左右?加入?核酸染料?倒入胶槽内?待自然凝固?附?录?资料性?蜜蜂孢子虫病?引物序列见表?表?蜜蜂孢子虫?引物序列引物序列产物大小?上游引物?下游引物?蜜蜂孢子虫镜检图例见图?图?蜜蜂孢子虫阳性镜检图?
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