1、动物源肠球菌分离与鉴定技术规程22中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX67.120.10CCS X41472022Technical code of practice for isolation and identification of Enterococcusfrom animals中华人民共和国农业农村部发 布2022?07?11发布2022?10?01实施41472022NY?/T414720222?前?言本文件按照?标准化工作导则?第?部分?标准化文件的结构和起草规则?的规定起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别专利的责任?本文件由农业农
2、村部畜牧兽医局提出?本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口?本文件起草单位?中国兽医药品监察所?四川省兽药监察所?本文件主要起草人?张纯萍?岳秀英?宋立?葛荣?赵琪?吴晓岚?崔明全?李然?徐士新?陆强?王鹤佳?王晓君?动物源肠球菌分离与鉴定技术规程?范围本文件规定了动物源肠球菌?的分离与鉴定方法?本文件适用于动物直肠?泄殖腔拭子?肠道内容物等样品中粪肠球菌?屎肠球菌的分离和鉴定?规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款?其中?注日期的引用文件?仅该日期对应的版本适用于本文件?不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用
3、水规格和试验方法?实验室?生物安全通用要求?术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义?试剂或材料?要求除另有规定外?所有试剂均为分析纯?水为符合?规定的三级水?培养基按附录?配制或用商品化产品?试剂?过氧化氢溶液?氰?羟基肉硅酸?色谱纯?甘油?溶液配制?过氧化氢溶液?取过氧化氢溶液?加水?混匀?现用现配?基质溶液?取?氰?羟基肉硅酸?按说明书配制?或用市售商品?灭菌甘油?取甘油适量?灭菌?培养基制备?运送培养基?按照附录?中?的规定执行?肠球菌增菌液?按照?的规定执行?肠球菌显色培养基?按照?的规定执行?胰酶大豆琼脂?按照?的规定执行?营养琼脂培养基?按照?的规定执行?营养肉汤?按照?的规定执
4、行?蔗糖脱脂乳保护剂?按照?的规定执行?标准菌株粪肠球菌?屎肠球菌?材料?革兰氏染色套装?革兰氏阳性菌生化鉴定卡或生化鉴定试剂盒?菌种冷冻保存管或磁珠保藏管?仪器设备?冰箱?或以下?恒温培养箱?分析天平?感量?高压灭菌锅?显微镜?二级生物安全柜?麦氏比浊仪?微生物生化鉴定系统?微生物质谱仪?计?测量范围?精度为?单位?其他常规设备及材料?样品采集与保存运输取灭菌棉签?插入直肠?泄殖腔?旋转数次?取出?置于?氏运送培养基中?取肠道内容物或粪便?置于无菌塑封袋或其他密闭容器中?保存?运输?分离与鉴定流程分离与鉴定流程见图?图?肠球菌分离与鉴定流程?增菌?动物直肠?泄殖腔拭子取单个动物直肠?泄殖腔拭
5、子?置于?肠球菌增菌液中?培养?肠道内容物取?样品?置于?肠球菌增菌液中?稀释?混匀?培养?分离纯化?分离取?的增菌培养液?接种肠球菌显色培养基?培养?纯化观察菌落形态?菌落呈圆形?边缘整齐?表面光滑?隆起?不透明?灰白色小菌落?直径为?在菌落周围形成黑色晕轮?其他肠球菌显色培养基上的菌落形态参照说明书?挑取单个可疑肠球菌菌落?接种于肠球菌显色培养基?培养?挑取纯化后的单菌落接种胰酶大豆琼脂?或营养琼脂培养基?培养?备用?筛查与鉴定?肠球菌属的鉴定?形态观察取纯化菌?革兰氏染色?镜检?呈单个?成双或短链排列?无芽孢?无荚膜?过氧化氢酶?触酶?试验取玻片?滴?过氧化氢溶液?滴?滴?挑取菌落?混合
6、?若?内出现气泡则判定为阳性?粪肠球菌和屎肠球菌的鉴定?通用要求生化鉴定和质谱鉴定任选其一?生化鉴定取纯化菌?按革兰氏阳性菌生化鉴定卡或生化鉴定试剂盒说明书进行操作和结果判定?质谱鉴定?菌样制备挑取单个新鲜纯化菌落?均匀涂布于靶板样品孔中?涂布厚度为薄薄一层?室温干燥?吸取?基质溶液滴于样品上?混匀?室温干燥?标准菌株的新鲜菌落同法操作?仪器校准检测样品前?应对微生物质谱仪进行校准?测定取制备好的样品靶板?置于质谱仪靶板槽中?编辑样品信息后?进行谱图的数据采集?结果判定与报告微生物质谱仪自动完成谱图的比对和鉴定?以不同颜色?不同分值显示结果?菌株鉴定位点显示绿色?鉴定分值达到种水平可信即可?粪肠球菌和屎肠球菌标准菌株的质谱鉴定谱图见附录?菌株保存取新鲜纯化菌?加无菌生理盐水制成菌悬液?与灭菌甘油溶液混合?使甘油终浓度为?或加入磁珠保藏管?或加入?蔗糖脱脂乳保护剂?冻干?或以下保存?生物安全措施实验室设施设备?人员防护?实验安全操作?实验废弃物及菌株处理应符合?的要求?附?录?规范性?培养基与试液?运送培养基?成分硫乙醇酸钠?氯化钠?磷酸氢二钠?氯化钙?琼脂?水?制法将?中各成分溶于水中
安全达人 