1、2023?12?22发布2024?05?01实施动物冠状病毒通用RT-PCR检测方法41中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX11.220CCS B44362023Universal RT-PCR assay for animal coronavirus中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:中国动物卫生
2、与流行病学中心.本文件主要起草人:王楷宬、庄青叶、王素春、潘俊慧、李阳、张富友、李超、李金平、侯广宇、蒋文明、王静静、刘朔、于晓慧、袁丽萍、左媛媛、尹馨、刘华雷.N Y/T 引言冠状病毒在分类地位上属于套式病毒目(N i d o v i r a l e s)、冠状病毒亚目(C o r n i d o v i r i n e a e)、冠状病毒科(C o r o n a v i r i d a e).年,国际病毒学分类委员会(I n t e r n a t i o n a lC o mm i t t e eo nT a x o n o m yo fV i r u s e s,I C T V)将冠
3、状病毒科分为L e t o v i r i n a e病毒亚科和正冠状病毒亚科(O r t h o c o r o n a v i r i n a e)个亚科.其中,L e t o v i r i n a e病毒亚科仅包括一个属,即A l p h a l e t o v i r u s属;而正冠状病毒亚科则包括、和个属.冠状病毒具有宿主多样性,人和多种动物,如猪、牛、羊、禽、犬、猫、鼠、骆驼、蝙蝠、鲸鱼等均可感染,甚至引发严重疾病,严重威胁人类健康和畜牧业生产安全.目前发现的人和动物冠状病毒至少包括 个种,有的种还包含多个不同的病毒株.我国常见的动物冠状病毒,如猪传染性胃肠炎病毒(T G E
4、V)、猪流行性腹泻病毒(P E D V)、牛冠状病毒(B C o V)、马冠状病毒(E C o V)、猫传染性腹膜炎病毒(F C o V)、犬冠状病毒(C C o V)和鸡传染性支气管炎病毒(I B V)等动物冠状病毒可引起动物发病、死亡,给畜牧业造成严重的经济损失.基于国内外动物冠状病毒的流行形势,亟须建立一种动物冠状病毒通用筛查方法.本文件可用于检测各类动物冠状病毒,对动物疫病防控和公共卫生安全具有重要意义.N Y/T 动物冠状病毒通用R T P C R检测方法范围本文件规定了动物冠状病毒通用R T P C R检测方法的技术要求.本文件适用于动物组织、分泌物、排泄物及其培养物等样品中动物冠
5、状病毒核酸的检测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 分析实验室用水规格和试验方法G B 实验室生物安全通用要求NY/T 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.缩略语下列缩略语适用于本文件.b p:碱基对(B a s eP a i r)P B S:磷酸盐缓冲液(P h o s p h a t e B u f f e r e dS a l i n eB u f f e r)R d R
6、p:R NA依赖性R NA聚合酶(R NA d e p e n d e n tR NAP o l y m e r a s e)R NA:核糖核酸(R i b o n u c l e i cA c i d)R T P C R:逆转录聚合酶链反应(R e v e r s eT r a n s c r i p t i o n P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n)试剂和材料 试剂 除另有规定外,所用试剂均为分析纯,所用水符合G B/T 规定的二级水.P B S(m o l/L,p H ),配制方法按照附录A中A 的规定执行.R NA提取试剂盒.R T P C R一步法扩增试剂盒或其他等效的R T P C R扩增试剂盒.D NA分子量标准(D L b p或其他等效力分子量标准).上样缓冲液(参照所选购上样缓冲液的说明使用).电泳缓冲液,配制方法按照A 的规定执行.阳性对照:经过培养的鸡传染性支气管炎或猪流行性腹泻病毒.阴性对照:S P F鸡胚尿囊液或V e r o细胞培养物.引物引物针对冠状病毒的R d R p基因的保守区域设计,上游引物C o
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