动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程NYT4148-2022.pdf

1、动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程22中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX67.120.10CCS X41482022Technical code of practice for isolation and identification of Campylobacterfrom animals中华人民共和国农业农村部发 布2022?07?11发布2022?10?01实施41482022NY?/T414820222?前?言本文件按照?标准化工作导则?第?部分?标准化文件的结构和起草规则?的规定起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别专利的责任?本文件由农

2、业农村部畜牧兽医局提出?本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口?本文件起草单位?中国动物卫生与流行病学中心?中国兽医药品监察所?本文件主要起草人?王娟?张纯萍?曲志娜?赵琪?刘俊辉?黄秀梅?宋立?李雪莲?张青青?李月华?刘娜?王琳?崔明全?王君玮?王鹤佳?徐士新?动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程?范围本文件规定了动物源弯曲杆菌?的分离与鉴定方法?本文件适用于动物直肠?泄殖腔拭子?新鲜粪便?肠道内容物等样品中空肠弯曲杆菌?结肠弯曲杆菌的分离和鉴定?规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款?其中?注日期的引用文件?仅该日期对应的版本适用于本文件?不注日期

3、的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?实验室?生物安全通用要求?术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义?试剂或材料?要求除另有规定外?所有试剂均为分析纯?水为符合?规定的三级水?培养基按附录?配制或用商品化产品?试剂?四甲基对苯二胺盐酸盐?过氧化氢?聚合酶链式反应预混液?琼脂糖?缓冲液?氰?羟基肉硅酸?色谱纯?溶液配制?氧化酶溶液?取四甲基对苯二胺盐酸盐?加水适量使溶解?并稀释至?过氧化氢溶液?取?过氧化氢?水?混匀?马尿酸钠水解试剂?按照附录?中?的规定执行?缓冲液?取?缓冲液?加水定容至?琼脂糖凝胶?取琼脂糖?于?缓冲液中加热?充分溶解?基

4、质溶液?取?氰?羟基肉硅酸?按说明书配制?或用市售商品?培养基制备?氏运送培养基?按照?的规定执行?肉汤?按照?的规定执行?改良?琼脂?按照?的规定执行?血琼脂?按照?的规定执行?弯曲杆菌显色培养基?按说明书配制?哥伦比亚血琼脂?按照?的规定执行?布氏肉汤?按照?的规定执行?蔗糖脱脂乳保护剂?按照?的规定执行?标准菌株空肠弯曲杆菌?结肠弯曲杆菌?材料?吲哚乙酸酯纸片?生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡?磁珠保藏管?器材设备?二级生物安全柜?恒温培养箱?冰箱?或以下?恒温振荡培养箱?分析天平?感量?高压灭菌器?振荡器?微需氧培养装置?提供微需氧条件?氧气?二氧化碳和?氮气?显微镜?高速冷冻离心机?麦氏比

5、浊仪?微生物生化鉴定系统?仪?核酸电泳仪?电泳凝胶成像分析系统?微生物质谱仪?涡旋混合器?冷冻干燥机?样品采集与保存运输取灭菌棉签?插入直肠?泄殖腔?旋转数次?取出?置于?氏运送培养基中?采集肠道内容物或粪便?置于无菌塑封袋或其他密闭容器中?保存运输?不宜超过?分离鉴定程序弯曲杆菌分离与鉴定流程见图?图?弯曲杆菌分离与鉴定流程?增菌?动物直肠?泄殖腔拭子取单个动物直肠?泄殖腔拭子?置于?肉汤中?在微需氧条件下?培养?肠道内容物?粪便取?样品?置于?肉汤中?稀释?混匀?在微需氧条件下?培养?分离纯化?分离取增菌液?划线接种?血琼脂?改良?琼脂平板或弯曲杆菌显色培养基?在微需氧条件下?培养?纯化取

6、出平板?观察菌落形态?血琼脂平板上可疑菌落为灰色?扁平?湿润有光泽?呈沿接种线向外扩散生长的倾向?或呈分散凸起的单个菌落?边缘整齐?发亮?改良?琼脂平板上的可疑菌落为淡灰色?有金属光泽?潮湿?扁平?呈扩散生长的倾向?弯曲杆菌显色培养基上的菌落形态参见商品说明书?挑取可疑菌落?接种哥伦比亚血平板?在微需氧条件下?培养?筛查与鉴定?菌属鉴定?形态观察取纯化菌?革兰氏染色?镜检?弯曲杆菌为革兰氏阴性?呈弯曲小逗点状或?形?螺旋状?海鸥展翅状?动力观察取纯化菌?悬浮于?布氏肉汤中?用显微镜观察?弯曲杆菌呈螺旋状运动?氧化酶试验挑取纯化菌落?置于氧化酶试剂润湿的滤纸上?内弯曲杆菌出现紫红色?紫罗兰色或深蓝色?生长试验取纯化菌?接种哥伦比亚血平板?分别置于微需氧条件下?和有氧条件?培养?弯曲杆菌均不生长?空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的鉴定?通用要求生化鉴定?鉴定?质谱鉴定?种方法任选其一?生化鉴定?过氧化氢酶试验取?过氧化氢溶液?滴?滴至玻片上?挑取菌落与之混合?内出现气泡则判定为阳性?马尿酸钠水解试验挑取菌落?加?马尿酸钠溶液?混匀?制成菌悬液?置于?水浴中孵育?或培养箱孵育?沿试管壁缓缓加入茚三