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1、电泳技术,第一节前言,首次应用于生物学,首次称为电泳,一、电泳 历 史,1809年，俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验。显示了电渗透现象，为电泳理论和技术的发展奠定了基础。,电泳前,电泳后：阳极粘土颗粒上移，浑浊 阴极清澈，水面上升,Tiselius 电泳槽（C）和电极（V1和V2）,Tiselius和移动界面电泳,获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、球蛋白组成的。,移动界面电泳使解决生理学和医学问题达到了一个新水平！,电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。,例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带

2、正电荷，向负极移动。当蛋白质溶液pH值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。,二、电泳的分类（一）按分离的原理区分：电泳按分离的原理可分为4种，即区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)等电聚焦(isoelectric cusing，IEF)。,1、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的峰2、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。3、等速电泳 在电泳达

3、成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。,（二）按有无固体支持物区分,根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。自由电泳又可分为：显微镜电泳(也称细胞电泳)；移界电泳；柱电泳；自由流动幕电泳；等速电泳；,按有无固体支持物区分又可以分为:自由电泳和支持物电泳两大类,凝胶电泳,五十年代后，才开始固体介质电泳,使电泳技术得到了更快的发展

4、,总之，各种电泳技术具有以下特点：凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析；样品用量极少；设备简单；可在常温进行；操作简便省时；分辨率高。,一、Tiselius移界电泳法Tiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题：能够形成清晰的起始界面；靠密度梯度能够稳定界面；能良好的散热；在泳动过程中可用光学方法显示其组分。,第二节 常用的电泳技术,二、区带电泳,1、滤纸及醋酸纤维素薄膜电泳它具有简单快速等优点：电泳区带界限清晰；通电时间较短(20min至1 h)；对各种蛋白质基本无吸附，因此无拖尾现象；不吸附染料，显示电泳区带背景干净。,2、高

5、压电泳高压电泳适用于分离低分子物质，如氨基酸、肽、抗生素及其他有机和无机物。因为低分子物质易扩散，高电压可使其移动快，在短时间内达到分离，减少扩散的影响。,3、连续电泳用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样，缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。分离的成分由下方分别以试管收集,4、凝胶电泳,（1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖,相关知识：影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素迁移速率由DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA的构象所加电压电场方向碱基组成与温度嵌入染料的存在电泳缓冲液的组成等许多参数

6、确定。,琼脂糖凝胶电泳装置,实验步骤,制 胶,90以上熔化，凝胶温度35-43,EB,1、孔深 2、预留尺寸 3、梳子宽度 1+2=胶的厚度,3,加缓冲液,拔梳子,最好在电泳槽中,点 样,-,+,电 泳,紫外,电泳结果分析,DNA空间结构电压 EB,脉冲电场（PFGE）解决大分子DNA电泳问题,（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 WeintraubL建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。,几个原理及名词：,凝胶原理,SDS作用与变性、非变性,连续与不连续,缓冲液,样品缓冲液,凝胶缓冲液,电泳缓冲液,1xSDS:50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8)100 mmol/L DTT2%SDS 0.1%溴酚蓝10%甘油,Tris 碱 用盐酸一次调PH成功0.1%SDS,1xTris 甘氨酸:25 mmol/L Tris250 mmol/L 甘氨酸(PH