牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程TNXSLX 0208-2025.pdf

1、牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程TNXSLX 0208-2025讲解了以牛耳缘组织为来源的成纤维细胞分离、纯化、鉴定、基因编辑及细胞冻存与复苏的全流程标准化操作。该文件明确了适用于牛基因编辑研究和应用的技术路径，规定了术语定义、实验室环境与设施要求、试剂耗材标准以及具体操作步骤。在细胞制备方面，详细描述了组织块法分离成纤维细胞的过程，包括无菌采集耳缘组织、剪切成小块后贴壁培养、观察细胞迁出、胰酶消化传代及差速贴壁纯化等环节，并通过形态学特征和免疫荧光染色（Vimentin阳性、Cytokeratin阴性）进行细胞鉴定。在基因编辑部分，重点围绕CRISPR/Cas9系统展开，涵盖gRNA设计、核

2、转染导入、单细胞克隆筛选、RFLP或T7E1初步检测突变效率，以及PCR扩增后测序验证编辑结果。文件还对编辑细胞的冻存与复苏提供了规范方法，包括程序降温或分层降温策略、液氮长期保存、快速水浴复苏及DMSO清除流程。质量控制方面，要求对细胞活性（台盼蓝染色）、无菌状态（细菌、真菌、支原体检测）、编辑准确性（Sanger或NGS测序）和核型稳定性进行系统检验。同时强调全过程记录管理，需填写供体信息、操作参数、冻存位置、检验结果等档案表格，确保可追溯性和实验重复性。整个规程融合了生物安全、动物福利伦理、实验室良好规范等多项国家标准，构建了一个科学、可控、可复制的技术体系。牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程TNXSLX 0208-2025适用于从事畜禽遗传改良、动物生物技术研究、农业生物科技研发及相关领域的科研机构、高等院校、种业企业、兽药与疫苗生产企业和转基因动物研发中心。尤其适用于开展牛体细胞克隆、基因组编辑育种、疾病模型构建、生物医药生产（如重组蛋白表达）等工作的实验室和技术团队。该规程为需要进行高精度基因编辑操作并依赖稳定成纤维细胞系建立的单位提供统一的技术依据，也可作为相关项目评审、质量认证、生物安全管理及科技成果转化的参考标准。同时适用于地方畜牧科技推广部门、农业科技园区及相关监管机构，在推动宁夏乃至全国范围内畜禽基因编辑技术规范化发展方面具有重要指导意义。