1、犐 犆犛 犆犆犛犅?犌犅犜?犕犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉狋 犺 犲犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犈狀 狋 犲 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪 犮 犲 犪 犲犻 狀犳 犲 犲 犱?前言本文件按照 标准化工作导则第部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（）提出并归口。本文件起草单位：江苏海企长城股份有限公司、中华人民共和国淮安海关、中华人民共和国南京海关、淮阴师范学院。本文件主要起草人：王远见、何健、宦海霞、冯民、刘尧、蒋原、任盈盈、高旭、朱海燕、柯家法、张扬、张
2、科、颜智勇、张敬友。犌犅犜 饲料中肠杆菌科的检验方法范围本文件描述了饲料中肠杆菌科检验的平板计数法和计数法。本文件适用于对饲料（含宠物饲料）的检验。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。肠杆菌科犈狀 狋 犲 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪 犮 犲 犪 犲在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。最可能数犿狅 狊 狋狆 狉 狅 犫
3、犪 犫 犾 犲狀 狌犿犫 犲 狉基于泊松分布间接计数方法得到的数值。缩略语下列缩略语适用于本文件。：缓冲蛋白胨水（）：菌落形成单位（）：肠道菌增菌（）：最可能数（）：营养琼脂（）：结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（）培养基或试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水：，三级。：按照附录中 执行。犌犅犜 提供下载 肉汤：按照 执行。：按照 执行。平板：按照 执行。葡萄糖琼脂：按照 执行。革兰氏染色液：按照 执行。氧化酶试剂：按照 执行。仪器设备 恒温培养箱：。水浴箱：。均质机。拍打式均质器。振荡器。电子天平：感量。显微镜：倍 倍。无菌培养皿：直径。无菌吸管：（刻度）、（刻度）或微量移液器及
4、吸头。试管：、。无菌锥形瓶或等效容器：、。均质袋、均质杯。计或精密试纸。取样取样制样遵循随机性、代表性的原则，采用无菌操作程序，样品数量不少于 （），需要混合均匀。应在接近原有贮存温度条件下贮存试样，并尽快完成检验。平板计数法 检验流程关键控制环节平板计数法检验流程关键控制环节按照图进行。犌犅犜 提供下载图平板计数法检验流程关键控制环节 试验步骤 试样处理 易粉碎固体试样：称取 试样，放入盛有 的无菌均质杯中，均质 ；或放入盛有 的无菌均质袋中，置于拍打式均质器中拍打 ，制成 倍稀释的试样匀液。不易粉碎固体试样：称取 以上的试样，装于均质袋中，按照比例加入适量，置于拍打式均质器中拍打 ，制成
5、倍稀释的试样匀液。液体试样：用无菌吸管吸取 试样放入盛有 无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中，置于振荡器中振荡，充分混匀，制成 倍稀释的试样匀液。用无菌吸管或微量移液器吸取 倍稀释的试样匀液，沿管壁缓缓注入盛有的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面），振摇试管或换用支无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 倍稀释的试样匀液。根据对试样污染状况的估计，按照上述操作，依次制成 倍递增系列稀释试样匀液。每递增犌犅犜 提供下载稀释次，换用支无菌吸管或吸头。从制备试样匀液至试样接种完毕，全过程不得超过 。接种和培养 根据试样的污染情况及不同种类饲料中肠杆菌科的限量要求，选
6、择个适宜的连续稀释度的试样匀液加入到无菌培养皿中，每个稀释度接种个无菌培养皿。同时，分别吸取加入个无菌培养皿中做空白对照。将约 冷却至 的（可放置于 恒温水浴箱中保温）倾注于培养皿中。小心旋转培养皿，使试样匀液与培养基充分混匀。待琼脂凝固后，再向其中倾注约的培养基覆盖平板表层，以防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。待培养皿中的培养基凝固后，翻转培养皿，置于 培养 。菌落计数和确认 肠杆菌科典型菌落为粉红色至红色或紫色菌落，菌落计数以表示。选取典型菌落数在 之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则计算半个平板后乘以，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。从每个平板上至少挑取个（小于个则全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取个菌落进行确认。分别将所挑选的每一个菌落，划线于平板，培养 ，挑取平板上的菌落进行典型菌落的确认：）革兰氏染色试验：将涂片在火焰
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