1、ICS65.150CCS B 52DB50重庆市地方标准DB50/T 16062024水生动物细菌性病原鉴定技术规范2024-07-08 发布2024-10-08 实施重庆市市场监督管理局发 布I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由重庆市水产技术推广总站提出。本文件由重庆市农业农村委员会归口并组织实施。本文件起草单位：重庆市水产技术推广总站、中国水产科学研究院长江水产研究所、西南大学、重庆市水产学会。本文件主要起草人：张利平、王波、李虹、梅会清、翟旭亮、周
2、勇、廖雨华、陈洁、马龙强、冯俊、薛明洋、薛洋、吴晓清、周春龙、何忠谊、徐凤、甘婷婷、陈波、刘晓莉、梅建西。1水生动物细菌性病原鉴定技术规范1范围本文件规定了水生动物细菌性病原鉴定的试剂、仪器设备、鉴定方法和无害化处理等技术要求。本文件适用于水生动物细菌性病原鉴定和相关疫病诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7015病死水生动物及病害水生动物产品无害化处理规范SC/T 72
3、01.1鱼类细菌性病检疫技术规程第1部分：通用技术3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside Triphosphate）TAE：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminomethane Acetate Salt）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）BHI：脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion Broth）BHIA
4、：脑心浸出液琼脂（Brain Heart Infusion Agar）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）5试剂实验用水、Taq DNA 聚合酶、dNTP、琼脂糖、10PCR 缓冲液（含 Mg2+，25 mmol/L）、核酸染料、BHI、BHIA。试剂配制见附录 A。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。6仪器设备超净工作台、生物安全柜、医用冰箱、高速离心机（100 rpm20 000rpm）、高压灭菌锅、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪、生化培养箱、移液器等。DB50/T 1606202427鉴定方法样品的制备7.1.1同一采样点每尾（只）动物个体视为
5、一个样本，同一采样点同一次采集的相似临床症状的样本不超过 5 个。优先采集有代表性的样本，即采集具有明显临床症状的发病动物或者离群、独游、濒死的动物。7.1.2用 75%酒精对待检测水生动物的表面进行擦拭消毒。7.1.3放置于已消毒解剖盘中，观察样品临床症状，若有，则用灭菌接种环或剪刀挑取部分病灶组织；若无病变，用灭菌剪刀和镊子，分别取肝、脾、肾等组织。平板划线分离及纯化7.2.1在超净工作台或生物安全柜中，用灭菌接种环蘸取病灶部位或其它组织在 BHIA 平板（或选择性培养基或血平板）上进行三区划线，做好编号标记。7.2.2将划线好的平板倒置在培养箱中，28 2 培养 16 h24 h。7.2
6、.3观察菌落生长情况，挑取优势单菌落（参见附录 B 图 B.1），在超净工作台或生物安全柜中用无菌接种环挑取单菌落到装有无菌 BHI 增菌液（或已知的适宜培养基）的离心管中（一个单菌落对应一个离心管），做好编号标记。挑取的不是单菌落，可稀释后重复划线纯化。7.2.4将挑取的单菌落放置在培养箱中，28 2 培养 16 h24 h，观察菌液状态，若浑浊，则于 4 保存待检。核酸模板制备7.3.1吸取 300L 的单菌落增菌液于无菌离心管中，12000 rpm/min 离心 2 min，弃上清。7.3.2加入 300L 的双蒸水，洗脱，12 000 rpm/min 离心 2 min；重复一次，弃上清。7.3.3离心管中加入 300L 的双蒸水，100 金属浴（或水浴）10 min，取出后马上放入冰中冷却，等冷却后 4、12 000 r 离心 10 min，吸取上清液作为核酸模板，放至无菌的离心管中冷藏备用；也可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其它方法抽提 DNA。PCR 检测7.4.116SrDNA 的通用引物上游引物27-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；下游引物149
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