1、 ICS 65.020.01 CCS B 05 13 河北省地方标准 DB 13/T 55242022 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记法 2022-02-28 发布 2022-03-31 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 55242022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北省农林科学院粮油作物研究所。本文件主要起草人：刘长友、田静、范保杰、曹志敏、王彦、王珅、苏秋竹、张志肖、王学清、刘少兴、彭秀国、刘阳。DB 13/T 55242022
2、 2 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本文件规定了SSR分子标记法鉴定抗豆象绿豆（Vigna radiata L.）品种真实性和纯度的仪器设备及试剂、供试样品、方法步骤和结果判断与计算方法。本文件适用于抗豆象绿豆品种真实性和纯度的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.1 农作物种子检验规程总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定
3、 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。绿豆象(Callosobruchus Chinensis)绿豆象为鞘翅目、豆象科（Bruchidae)的一种昆虫，又叫中国豆象、小豆象、豆牛，在我国各地均有发生，主要危害绿豆、小豆、豇豆等。抗豆象绿豆品种(Bruchids Resistant Mungbean Variety)在人工接种豆象鉴定的条件下，种子被害率小于65%的绿豆品种。标准样品（Standard Sample）国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。品种真实性(Varietal Genuineness)供检品种与该品
4、种的标准样品是否相符。品种纯度(Varietal Purity)品种在特征特性方面典型一致的程度，用与供检品种标准特征特性表现一致的本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。SSR 分子标记（Simple Sequence Repeats Marker）也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)标记，是基于单个微卫星位点的重复单元在数量上的变异而发展起来一种分子标记。微卫星中重复单位的数目在不同材料中存在高度变异，但其两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，根据这一特征设计引物进行PCR扩增，从而可以将单个微卫星位点扩增出来。由于重复单元的重复数目不同就产生扩增片段长度的多态性，
5、从而形成分子标记。核心引物（Core Primers）从大量引物中筛选出的一组扩增稳定、多态性较好、带型分布合理、能够用于区分不同材料遗传背景差异的引物组合。DB 13/T 55242022 3 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。4 仪器设备及试剂 仪器设备 高速离心机；PCR 扩增仪；高压电泳仪（3000 V,400 mA,400 W）；DNA 序列分析电泳槽；电子天平（0.01 g,0.001 g）；研钵或组织研磨仪；水浴
6、锅；通风橱；微量加样器（0.5 L10 L,20 L200 L,100 L1000 L）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计；冰箱；Nanodrop2000分光光度计；烧杯；镊子；量筒；容量瓶（500 mL，1000 mL）；离心管（1.5 mL，2 mL）；吸头(10 L，200 L，1000 L)；96 孔 PCR 板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒；水平仪；夹子等。试剂 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠；三氯甲烷（氯仿）；异戊醇；-巯基乙醇；三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）；37%浓盐酸；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA-2H 2O)；氢氧化钠；硼酸；40%非变性聚丙烯酰胺母液（19:1）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；硝酸银；甲醛；乙醇。注：所有试剂均为分析纯 溶液配制 DNA 提取及电泳相关试剂储备液配制见附录B。试剂配制所用水应符合GB/T 6682规定的一级水的要求，其中银染、显影溶液的配制可以使用符合三级水的要求。5 样品 送样 送验样品为种子，重量应不低于500 g。试验样品 从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取符合G
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