1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 13 河北省地方标准 DB 13/T 55732022 鸡粪肠球菌病综合诊断技术规程 2022-05-31 发布 2022-07-01 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 55732022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北工程大学、河北征宇制药有限公司。本文件主要起草人：柳焕章、刘建钗、张鹤平、刘利强、刘会洽、闫金坤、崔国林、王宏艳、刘彦威、刘娜、王春霞、程龙、刘学彬、李晶晶、娄路平、李夫宏。DB 13/T
2、 55732022 1 鸡粪肠球菌病综合诊断技术规程 1 范围 本文件规定了鸡粪肠球菌病临床诊断、实验室诊断和综合判定等技术要求。本文件适用于鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等粪肠球菌病诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。粪肠球菌 Enterococcus faecalis 为革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BEAA：叠氮钠-
3、结晶紫-七叶苷培养基；PCR：聚合酶链式反应；H-E染色：苏木精-伊红染色；TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基；TSB：胰蛋白胨大豆液体培养基；SDS：十二烷基磺酸钠；EDTA：乙二胺四乙酸。5 临床诊断 当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据。临床症状 各日龄禽均可感染，雏禽易感，呈眼神呆滞、眯眼、脐炎、呼吸困难等症状；青年禽呈轻微腹泻症状；成年禽出现产蛋量下降症状、种蛋孵化率明显降低，死胚明显。剖检病变 死胚皮下有胶冻样物质，肝脏呈土黄色；病雏卵黄吸收不全，肝脏发生不同程度坏死、淤血或出血，肺出血。成年禽病变不明显。6 实验室诊断 采用荧光定量PCR检测技术，结合临床症状确诊。荧光
4、定量 PCR 检测 6.1.1 样品采集 DB 13/T 55732022 2 选择临床有症状的病禽，采集肝肺等病变组织1 g，放入1.5 mL灭菌EP管中，编号，-20 保存备用。6.1.2 基因组 DNA 提取 取组织样本0.2 g放入组织研磨器中研磨，收集样本0.05 g0.1 g于1.5mL EP管中，加入500 L裂解液（400 mM Tris-HCl pH 8.0，60 mM EDTA）pH 8.0，150 mM NaCl，1%SDS），室温放置10 min；加150L乙酸钾（pH 4.8），漩涡震荡，12000 g离心1 min，取上清液放入新试管，加入等体积异丙醇；DNA团块用
5、70%乙醇清洗，干燥后溶解在50 L TE（10 mM Tris，1 mM EDTA）中保存。或者使用DNA提取试剂盒提取。6.1.3 引物合成 参照GenBank中粪肠球菌sodA 基因，使用Primer Express 5.0软件设计粪肠球菌特异性引物（预期扩增片段大小360bp）：上游引物F：5-ACTTATGTGACTAACTTAACC-3 下游引物R：5-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3 6.1.4 荧光定量 PCR 反应体系和反应程序 采用25L的反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2）12.5 L，上、下游引物各0.5 L，DNA模板1.0 L，用双蒸水
6、补足至25 L。反应程序为：93 预变性5 min；93 15 s，58 15 s，72 30 s，进行40个循环，72 延伸7 min，于4 终止反应。6.1.5 荧光 PCR 结果判断 当待测样品实时荧光定量PCR检测结果有“S”型扩增曲线，Ct值36.5，且Tm值为86 时，判定待测样品中含有鸡粪肠球菌，而且可通过Ct值大小判断感染的程度（参见附录A）。综合判定 结合临床症状、病理变化和荧光定量PCR检测结果，可确诊鸡粪肠球菌病。7 剖检尸体和污染物处理 病害鸡只及其产品的生物安全处理应符合GB 16548的规定。DB 13/T 55732022 3 A A 附录A （资料性）感染程度推断 A.1 感染程度推断 定量PCR标准曲线的建立是在线性范围内以各浓度（108101）的对数为横坐标，以其对应的Ct值为纵坐标，用Excel制作标准曲线，得到回归方程 y=-2.44 x+30.53，决定系数 R2=0.9983。因此，可通过临床样品检测的Ct值计算出其所含病原体的浓度和数量，从而推断感染的程度。
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