1、2023?12?22发布2024?05?01实施牛蜘蛛腿综合征检测PCR法43中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.020.30CCS B44222023Detection of arachnomelia syndrome in cattlePCR method中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种业管理司提出.本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:
2、中国农业大学、新疆农业大学.本文件主要起草人:王雅春、初芹、焦士会、黄锡霞、谢振全、田月珍、马毅、俞英、张毅、王丹、胡丽蓉.N Y/T 牛蜘蛛腿综合征检测P C R法范围本文件描述了牛蜘蛛腿综合征检测的P C R法.本文件适用于西门塔尔牛、瑞士褐牛、中国西门塔尔牛、新疆褐牛、三河牛、蜀宣花牛及其他含有西门塔尔牛和/或褐牛血缘个体的蜘蛛腿综合征的遗传检测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 转基因产品检测实验室技术要求G B
3、/T 牛个体及亲子鉴定微卫星D NA法农业部 号公告 转基因动物及其产品成分检测普通牛(B o s t a u r u s)内标准基因定性P C R方法NY/T 牛遗传缺陷基因检测技术规程NY/T 奶牛短脊椎畸形综合征检测P C R法术语和定义下列术语和定义适用于本文件.牛蜘蛛腿综合征a r a c h n o m e l i as y n d r o m e,A S一种牛的先天性、致死性骨骼系统畸形、临床表现四肢外观像“蜘蛛腿”的常染色体遗传病.注:患病犊牛头部畸形,包括下颌骨短,上颌骨向下凹陷,上颌前端呈圆锥形,并向上微微翘起;脊柱向背侧弯曲,明显“蜷缩驼背”状态,但肋骨和肩胛骨正常;四肢
4、僵直,骨骼畸形,后肢畸形尤为严重,掌骨和跖骨向内侧弯曲与身体平行或呈一定角度,长骨骨端正常,长骨骨干比正常犊牛细而脆弱,外径和内径偏小但骨密质部分的宽度未发生改变,四肢外观像“蜘蛛腿”.来源:NY/T ,有修改原理根据褐牛A S致因突变位点和西门塔尔牛A S致因突变位点的侧翼序列设计特异性引物,并在上游引物 端分别加上HE X和F AM荧光标记,随后对D NA样品进行P C R扩增,获得与预期片段大小一致的P C R产物.P C R产物变性解链后,经毛细管电泳技术进行片段分离,依据荧光吸收峰图鉴定片段长度,判定基因型,确定被检个体为携带者还是正常个体.注:褐牛A S致因突变位点为牛号染色体上亚
5、硫酸盐氧化酶(s u l f i t eo x i d a s e,S U O X)基因外显子上 b p b p之间的个G碱基插入,c D NA上的位置为 b p b p,即表示为c i n s G位点.注:西门塔尔牛A S致因突变位点为牛 号染色体上钼辅因子合成蛋白(m o l y b d e n u mc o f a c t o rs y n t h e s i s,MO C S)基因外显子 上 b p b p处的C A碱基缺失,c D NA上的位置为 b p b p,即表示为c d e l C A位点.试剂和材料 主要试剂和配制除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离
6、子水或相当纯度的水.N Y/T 去离子甲酰胺(纯度为 ).D NA分子量标记:可以清楚区分 b p b p的D NA片段.T a qD NA聚合酶.P C R缓冲液.氯化镁溶液(mm o l/L).乙二胺四乙酸溶液 mm o l/LE D T A(p H ):称取二水乙二胺四乙酸二钠 g,溶于 m L水中,加氢氧化钠约 g,调p H至 ,加水定容至 m L.高压灭菌条件为 ,P a,蒸汽灭菌 m i n.T A E储存液:称取 g三羟甲基氨基甲烷(T r i s),先用 m L水加热搅拌溶解后,加入 m L乙二胺四乙酸溶液(),用冰乙酸调p H至 ,然后加水定容至 m L.T A E缓冲液:T A E储存液 m L(),加水定容至 m L.凝胶载样缓冲液:称取 g溴酚蓝、g二甲苯氰、g蔗糖,加水溶解后,定容至 m L,保存.d NT P s混合溶液(各 mm o l/L):将浓度为 mm o l/L的d AT P、d T T P、d G T P、d C T P种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.荧光标记引物 S U O X基因荧光标记引物S UO X F:C T C AAGAG T C A
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