1、ICS 65.020.20 B 05 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 17672013 苹果品种 DNA 指纹鉴定 2013-09-05 发布 2013-09-30 实施河北省质量技术监督局 发 布 DB13/T 17672013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河北省林业厅提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：刘兴菊、杨敏生、梁海永、张军、左立辉、李雪雁、姚伟明、杨立华、韩志校魏姗姗、甄红伟、王瑞霞。DB13/T 17672013 1 苹果品种 DNA 指纹鉴定 1 范围 本标准规定了苹果品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。本标
2、准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA指纹库的建立。2 原理 不同苹果品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从苹果幼苗、叶片等组织中提取总DNA，利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA指纹谱带类型。3 仪器设备及试剂 苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。4 溶液配制 苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。
3、5 鉴定方法 5.1 样品准备 5.1.1 取样量 每份送检样品至少检测3个个体，每个个体至少1g，对一致性差的样品应至少检测5个个体。5.1.2 品种比较方式 a)成对品种的比较 送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。b)品种与 DNA 指纹库入库品种的比较 送检样品可提供一份。将待检样品与 DNA 指纹库所有入库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。5.2 DNA 提取 DB13/T 17672013 2 5.2.1 宜采用改良的 C
4、TAB 法。取 200mg 干净叶片置入 1.5mL 离心管中，加入 500LDNA 提取液研磨碎，并加 1mL 洗涤液及 30L-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上 5min，于 4，12000 g 离心 8min 后，洗涤一次，弃上清，再加 700L 预热的 CTAB 缓冲液,充分混匀后，于 65水浴 60min，其间颠倒几次。然后于室温冷却4 min5min，取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25241),混匀抽提，室温静置5min，于室温 12000 g 离心 8min。上清液移于一新的 1.5mL 离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(241)，充分混匀后室温静置 5min，室温 12000g
5、离心 8min，取上清，重复加等体积氯仿异戊醇(241)抽提，取上清加入等体积氯仿抽提一次，取上清液，加入 2 倍体积的无水乙醇(-20)，轻轻混匀后在-20沉淀 30 分钟以上，12000 g 离心 10min，将所得沉淀风干后溶于 100L 水中，置 4冰箱备用。5.2.2 其它保证 DNA 质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行 DNA 质量与浓度检测。5.3 PCR 扩增 5.3.1 SSR 扩增 基本核心引物名单见附录C。5.3.2 反应体系 反应液体积为20L，组分配制应符合表1的规定（或按比例减少至10L）。表1 PCR 反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应
6、体积 L ddH2O 13.35 10buffer 10 1 2 MgCl2 25mmol/L 2.5mmol/L 2 dNTP 2.5mmol/L 0.15mmol/L 1.2 Taq 酶 5U/L 1U 0.2 引物 20mol/L 0.25mol/L 0.25 DNA 3050ng/L 1.52.5 ng/L 1 5.3.3 反应程序 94预变性5min；94变性50s，55退火50s，72延伸50s,共30个循环；72延伸7min，4保存。5.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.4.1 清洗玻璃板 用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5 mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5 mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。5.4.2 组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。DB13/T 17672013 3 5.4
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