1、ICS 67.120.30 B 50 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 17782013 鱼类链球菌病诊断技术规范 The norm of diagnosis technique for streptococcicosis in fish 2013-09-05 发布 2013-09-30 实施河北省质量技术监督局 发 布 DB13/T 17782013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。本标准主要起草人：侯金良、张志华、马瑞欣、李同庆、孙伟彬、邵铁凡、梁艳红、田洋、苏欢欢、薛政
2、。DB13/T 17782013 1 鱼类链球菌病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了鱼类链球菌病的诊断方法。本标准适用于鱼类链球菌病病原菌的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 病原菌 链球菌（Streptococcus）呈球形或卵圆形，在液
3、体培养基中以成对或链状出现；革兰氏阳性、触媒阴性、兼性厌氧；在血平板上通常溶血。引起鱼类链球菌病的有海豚链球菌（Streptococcus iniae）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、米氏链球菌（Streptococcus millieri）、副乳房链球菌（Streptococcus parauberis）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）。其中海豚链球菌和无乳链球菌是引起鱼类链球菌病的主要病原菌。4 设备和材料 设备和材料包括：a)恒温培养箱。b)显微镜：10100。c)灭菌乳钵。d)天平：精度 0.1g。e)恒温水浴锅。f
4、)带有热盖功能的 PCR 仪。g)电泳仪。h)紫外分析仪或紫外观察灯。i)灭菌剪刀、镊子。j)高压灭菌器。DB13/T 17782013 2 5 培养基和试剂 培养基和试剂包括：a)水：应符合 GB/T 6682 的要求。b)Todd-Hewitt 肉汤（简称 THB)。c)血琼脂平板：按 GB/T 4789.28 中规定。d)75酒精。e)革兰氏染色液：按 GB/T 4789.28 中规定。f)3 H2O2 溶液（临时配制）。g)Taq DNA 聚合酶。h)酚/氯仿/异戊醇（25241）。i)琼脂糖。j)溴化乙锭（EB）。k)标准菌株：海豚链球菌和无乳链球菌标准菌株。l)dNTP：含 dAT
5、P、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 10mmol/L。m)PCR 引物：本标准以链球菌延伸因子（EF-Tu）tuf 基因设计一对引物。扩增片段大小为 639bp。使用时浓度为 10mol/L。其序列如下：E1:5GGACCAATGCCACAAACTCG3 E2:5TGGAGTATGACGTCCACCTTC3 n)DNA 分子质量标准（Marker）。o)无水乙醇：使用前预冷至-20。6 诊断步骤 6.1 活动情况观察 患病鱼游动缓慢，缺乏活力，分散于缓流处，浮于水面，或头向上尾向下呈悬垂状；临死前，病鱼或间断地狂游、翻滚、转圈。6.2 外部检查 患病鱼单侧或双侧眼球突出、充血，角膜混浊；
6、体色发黑，肛门红肿；鳃贫血，鳃盖下缘、胸鳍基部有出血现象；体表有 l 处或多处隆起，尤以尾部为多见，隆起部位出血或溃疡。6.3 解剖检查 患病鱼脑部充血，有出血点；肝脏肿大、出血，或脂肪变性、褪色；脾脏肿大，呈暗红色；胆囊、肾脏肿胀；胃肠或腹腔积水，肠壁充血发炎。6.4 病原菌的实验室常规鉴定 6.4.1 涂片检查 用 75%酒精棉球擦拭鱼体，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官的小块组织,在洁净载玻片上涂片,风干后,革兰氏染色（按 GB/T 4789.28 中的规定）后镜检。如见紫色球菌则表明病料中可能含有链球菌。DB13/T 17782013 3 6.4.2 病原菌分离培养 对于有明显症状的鱼，用经火焰灭菌并冷却的接种环于病灶或内部组织无菌取材后划线接种于血琼脂平板。对于无明显症状的鱼，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官共 25g 组织匀质,加入 225mL灭菌的 THB 增菌液（见附录
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