1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 35512024 呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程 Technical code of germplasm resources cryopreservation on Hulunbeier sheep 2024-07-15 发布 2024-08-15 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 35512024 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文
2、件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所、吉林农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院、中国科学院西北高原生物研究所、赤峰学院。本文件主要起草人：房义、薛树媛、杨其恩、李九月、莫显红、贾功雪、冯春涛、钟荣珍、郭晓飞、毕江华。DB15/T 35512024 1 呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程 1 范围 本文件规定了呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻解冻液制备、低温平衡、冷冻、贮存及解冻技术要点。本文件适用于呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻保存。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注
3、日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 26613 呼伦贝尔羊 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 DB15/T 1769 绵羊冷冻精液 DB15/T 3401 奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程 3 术语和定义 GB/T 26613界定的以及下列术语和定义适用于本文件。开放式拉长细管 open pulled straw 卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存的容器。胚胎保存液 holding 用于胚胎体外发育的一种商品化溶液。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BSA：牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）COCs：卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-
4、Oocyte Complexes）DMSO：二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide）EG：乙二醇（Ethylene Glycol）FBS：胎牛血清（Fetal Bovine Serum）OPS：开放式拉长细管（Open Pulled Straw）DB15/T 35512024 2 PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Solution）TS：玻璃化解冻液（Thawing Solution）VS：玻璃化冷冻液（Vitrified Solution）5 精液冷冻保存 冷冻稀释液配制 按照附录A中表A.1规定的配方配制。标记 按照DB15/T 1769的规定执行。精液
5、要求 精子活力70%、密度0.8109个/mL、畸形率15%，颜色为乳白色。精液处理 原精液用PBS稀释5倍，缓慢搅拌，孵育5 min，以600 rpm离心10 min，移除上清液。稀释和平衡 离心处理后的精子，用I液稀释至2108个/毫升，在4 冰箱平衡2 h后，再用等体积II液稀释至1108个/毫升，再平衡1.5 h。装管 在4 条件下，将精液分装到0.25 mL细管中，另一端封口。冷冻 5.7.1 程序化冷冻 利用程序冷冻仪，在4-35 温区，设置6/min的降温速率；在-35-100 的温区，设置20/min的降温速率，然后投入液氮。5.7.2 熏蒸冷冻 将液氮倒入深度50 cm以上的
6、泡沫箱预冷10 min，细管铺放在支架后放入泡沫箱，支架平面距离液氮面4 cm，熏蒸7 min，然后投入液氮。贮存 冻精细管以25支或50支包装单位投入液氮罐。解冻 取出冻精细管，室温空气浴5 s，然后放置于40 水浴10 s取出，无菌纸巾擦干备用。6 卵母细胞冷冻保存 DB15/T 35512024 3 冷冻方法 OPS法。卵母细胞选择 挑选至少有3层卵丘颗粒细胞的COCs，体外成熟24 h后，在含0.1%（w/v）透明质酸酶中消化，去除卵丘颗粒细胞，挑选胞质均匀、折光性好、排出第一极体的裸卵。试剂与溶液 按照附录A中表A.2规定的配方配制。冷冻 6.4.1 OPS 制备 将0.25 mL细管加热变软后拉成为管壁内径为0.2 mm，管壁厚0.02 mm的OPS管，冷却后用手术刀片在其细端切开，细端长度约2 cm。6.4.2 冻前准备 玻璃化冷冻液及使用器材在室温25 至少预热30 min，在培养皿中制作100L200 L的VS1和VS2液滴。保温杯倒入液氮，15 ml离心管壁扎眼儿、贴标签、记录羊只信息、卵母细胞质量和数量、日期等，放入保温杯中，用于OPS的收集。6.4.3 冷冻 将
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