1、 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9.4 02 0 2 4食品安全国家标准食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验 2 0 2 4-0 2-0 8发布2 0 2 4-0 8-0 8实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国 家 市 场 监 督 管 理 总 局发 布前 言 本标准代替G B4 7 8 9.4 02 0 1 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验。本标准与G B4 7 8 9.4 02 0 1 6相比,主要变化如下:修改了标准名称;标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品;增加了P C R鉴定方法作为选做内容;删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的
2、产黄色素和苦杏仁苷项目;修改了培养基和试剂p H调节方法;修改了预热、选择性增菌温度以及T S A平板的培养温度和时间;修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。G B4 7 8 9.4 02 0 2 4食品安全国家标准食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验1 范围本标准规定了食品中克罗诺杆菌(C r o n o b a c t e rs p p.)的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。2.1 恒温培养箱:3 61,4 1.51。2.2 冰箱:25,-2 0。2.3 恒温
3、水浴箱:4 1.51。2.4 天平:感量0.1g、0.0 1g。2.5 振荡器。2.6 无菌吸管:1m L(具0.0 1m L刻度)、1 0m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头。2.7 无菌容器:容量1 0 0m L、2 0 0m L、20 0 0m L。2.8 无菌培养皿:直径9 0mm。2.9 p H计或p H比色管或精密p H试纸。2.1 0 微生物生化鉴定系统。2.1 1 P C R仪。2.1 2 离心机:转速1 20 0 0r/m i n。2.1 3 凝胶成像系统或紫外检测仪。2.1 4 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪。2.1 5 P C R反应管。2.1 6 1.5m L
4、离心管。2.1 7 1 0L接种环。3 培养基和试剂3.1 缓冲蛋白胨水(b u f f e r e dp e p t o n ew a t e r,B PW):见A.1。3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(m o d i f i e dl a u r y ls u l f a t et r y p t o s eb r o t h-v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T-Vm):见A.2。3.3 克罗诺杆菌显色培养基。3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(t r y p t i c a s es o ya g a r,T S A):见A.3。3.5 生化
5、鉴定试剂盒。3.6 氧化酶试剂:见A.4。3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见A.5。1G B4 7 8 9.4 02 0 2 43.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见A.6。3.9 L-精氨酸双水解酶培养基:见A.7。3.1 0 糖类发酵培养基:见A.8。3.1 1 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.9。3.1 2 内转录间隔区(i t s)P C R引物见表1,基因扩增靶标参考序列见附录B。3.1 3 5U/L耐热D NA聚合酶。3.1 4 2.5mm o l/d NT P s:d AT P、d T T P、d C T P、d G T P。3.1 5 2 5mm o l/L M g C l2。3.1
6、6 1 0P C R缓冲液:见A.1 0。3.1 7 克罗诺杆菌质控菌株:具有菌种保藏资质单位提供的AT C C2 9 5 4 4或等效菌株。3.1 8 大肠埃希氏菌质控菌株:具有菌种保藏资质单位提供的AT C C2 5 9 2 2或等效菌株。3.1 9 D NA提取试剂:细菌基因组D NA提取试剂盒。3.2 0 商品化P C R反应预混液。3.2 1 标准(高熔点)琼脂糖:分析纯。3.2 2 核酸染色剂。3.2 3 分子质量标准:1 0 0b pD NAl a d d e r。3.2 4 5 0T A E电泳缓冲液:见A.1 1。3.2 5 6D NA加样缓冲液:见A.1 2。第一法 克罗诺杆菌定性检验4 检验程序克罗诺杆菌检验程序见图1。2G B4 7 8 9.4 02 0 2 4图1 克罗诺杆菌检验程序5 操作步骤5.1 前增菌和选择性增菌取检样1 0 0g(m L)置于无菌容器中,加入9 0 0m L已预热至4 11的B PW,用手缓缓地摇动至检样充分溶解后,3 6 1培养1 8h 2h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液,移取1m L转入1 0m Lm L S T-Vm肉汤中,4
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